• 細胞端粒酶活性檢測

    一、項目背景介紹

    端粒酶(Telomerase)是由RNA和蛋白質組成的一種核糖核蛋白酶。人端粒酶RNA組分(hTR)于1995年被克隆,其中含有端粒重復序列的模板(5’-CUAACCCUAAC-3’);蛋白質組分具有RNA依賴的DNA多聚酶活性。端粒酶能以自身RNA為模板復制合成端粒序列,端粒DNA是一系列重復的富含G的DNA序列,這一序列在生物進化中具有高度的保守型(-TTAGGG-),端粒在保護基因組DNA不被降解、防止染色體有害變異(染色體末端融合、重排、移位和缺失等)起重要作用)。端粒酶的功能包括添加端粒重復序列,端粒長度的穩定和維持,以及染色體的整體空間取向、結構完整性和穩定性。

    在胚性細胞等增殖活躍的細胞中具有端粒酶活性,而在正常成熟體細胞中端粒酶失活,同時還發現絕大多數永生性細胞株和腫瘤細胞株都呈端粒酶陽性,而在癌旁組織和正常組織中陽性率則很低,推測端粒酶可能是一個廣泛的腫瘤標志物,端粒酶反應超越了細胞的增殖限制,這可能是惡性腫瘤發生的一個先決條件。

    傳統的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎測定端粒酶活性,需要大量的樣品材料,且檢驗靈敏度受限,直到1994 年kim等采用端粒重復擴增法(Telomeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代。標準的TRAP法檢測是通過PCR擴增端粒酶反應的產物,使用放射性標記,經凝膠電泳后,通過放射自顯影顯示檢測結果。該方法相較于傳統的方法,檢測靈敏度有所提升,然而在檢測環節仍然操作繁瑣,且結果判讀存在主觀性。我公司采用的CELL STR ID®端粒酶TRAP+CE檢測方法,提升了檢測效率(全流程:4-6h),結果判讀更加自動化和標準化,且檢測靈敏度也有大幅度地提升。

     

    二、端粒酶檢測方法及流程介紹

    檢測端粒酶活性的常用方法:

    2.1、直接檢測端粒酶(蛋白及RNA的結合復合物)的活性,檢測它是否可以延伸RNA模板,然后跑膠或者探針雜交,檢測端粒cDNA延伸的長度,以此來判斷端粒酶的活性高低。(TRAP法)

    不足:經典方法,但該方法需要放射性同位素標記及制膠;重復性差、周期長、主觀判讀等。

    2.2、間接檢測端粒酶組分(催化亞基的mRNA量)的表達量。

    不足:本質是檢測端粒酶的一個組分蛋白TERT的mRNA的表達量, 但是在多數細胞中,端粒酶催化亞基的表達很難檢測到,且mRNA的表達量并不一定能準確反映端粒酶的活性強度,因端粒酶是一種由RNA及多種蛋白組成的復合物,TERT酶只是其中較為主要的一種蛋白。

     

    三、HKGENE端粒酶檢測(TRAP+CE)流程:

    3.1 樣本處理:端粒酶提取試劑盒,按照操作說明書,取適量細胞提取蛋白。-80°保存待用。   

    3.2 端粒擴增:端粒酶擴增試劑盒,按照操作說明,擴增端粒重復序列。

    3.3 端粒序列檢測:毛細管電泳檢測,按照操作說明進行檢測。

    3.4 端粒擴增產物結果分析: 按照SOP進行數據分析。

    3.5 報告整理:

     

    四、CELL STR ID®端粒酶檢測委托檢測流程

      4.1  電話或咨詢確認相關信息(價格、樣本要求、周期、付款及合同)

      4.2  送樣檢測,填寫電子訂單發送至微信:caijie037

      4.3  檢測分析、報告整理、結果發送。

        

    五、相關文獻:

               5.1Telomeres and telomerase: three decades of progress  JW Shay, WE Wright - Nature Reviews Genetics, 2019 - nature.com

       5.2  Alternative lengthening of telomeres: Models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet. 11:319–330. 2010. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

       5.3  Telomerase activity concentrates in the mitotically active segments of human hair follicles. J Invest Dermatol. 108:113–117. 1997. View Article : Google Scholar : PubMed/NCBI

       5.4  Detection of telomerase activity in human cells and tumors by a telomeric repeat amplification protocol (TRAP)  Methods in Cell Science 17: 1-15, 1995

    六、樣本要求及運輸

      細胞數量:≥1*10的6次方。1.5ml離心管

      干冰運輸。

     

    七、端粒酶檢測意義及延伸服務:

    端粒酶檢測意義:細胞成瘤性體外評估、細胞傳代穩定性評估、iPSC殘留檢測、端粒酶抑制劑效果評估 

    延伸服務:端粒酶檢測方法學驗證、提供配套自檢方案(儀器、試劑、軟件、技術培訓),便于用戶實現自主可控監測。同一套儀器可實現STR鑒定、種屬鑒定、菌種鑒定、端粒酶檢測、HLA分型、宿主細胞DNA片段殘留及片段大小分析等。

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